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立体选择性羰基还原酶及其在手性醇合成中的应用
张晓健, 刘倩, 柳志强, 郑裕国
化工进展    2021, 40 (3): 1142-1160.   DOI:10.16085/j.issn.1000-6613.2020-2124
摘要   （1240） HTML （67） PDF（pc） （3623KB）（1536）  

手性醇是重要的医药中间体与精细化工品，立体选择性羰基还原酶催化制备手性醇具有重要的研究与应用价值，受到国内外科学家和工程师的高度关注。本文主要围绕羰基还原酶的发现与分类、催化羰基还原反应的活性与立体选择性机制、酶的筛选挖掘与分子改造技术、辅酶还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（磷酸）的再生方法、羰基还原酶催化合成手性醇医药中间体与精细化学品技术开发与应用等方面展开综述。重点阐述了羰基还原酶催化制备降血脂、抗细菌或病毒感染、抗肿瘤、抗抑郁症、抗癫痫等重要疾病治疗药物中间体及脂肪族、芳香族手性醇精细化工品的国内外技术进展与应用，为高效能立体选择性生物催化剂的创制和手性化合物的生物合成提供理论借鉴和成功范例。



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图10 羰基还原酶不对称还原制备孟鲁司特手性中间体[100]
正文中引用本图/表的段落
孟鲁斯特（Montelukast）是第三代白三烯受体拮抗剂药物，由Merk公司开发，用于成人及儿童哮喘的预防和长期治疗，具有疗效稳定持久、安全性高、副作用少等突出优势。由2-[3-[3-[(E)-2-(7-氯-2-喳琳基)乙烯基]苯基]-3-氧代丙基]苯甲酸甲酯（酮酯M）不对称还原制备2-[3-(S)-[3-[2-(7-氯-2-喹啉基)乙烯基]苯基]-3-羟基丙基]苯甲酸甲酯[(S)-羟酯]是孟鲁司特合成的关键环节（图10）。1996年，Microbacterium sp. MB 5614被首次应用于(S)-羟酯的合成，产物e.e.>95%[100]。Codexis公司基于羰基还原酶ADH进行定向进化，开发了系列突变体，催化(S)-羟酯合成效率提高了2000倍，底物浓度为100g/L时，产率为99.3%，e.e.达99.9% [101]。来源于Candida albicans XP1463 (CCTCC M 2014382)的醛酮还原酶CaAKR，也对(S)-羟酯不对称合成展现出高催化活性与立体选择性，比酶活达145U/mg，产物e.e.>99%[92]。
丁螺环酮是一种强效的5-羟色胺5HT1A受体部分激动剂，在脑中侧缝际区与5-HT1A受体高度结合，能减少体内5-羟色胺受体敏感性起到抗抑郁的作用.丁螺环酮无镇静、催眠、中枢性肌肉松弛等副作用，无成瘾性，广泛应用于抑郁症、焦虑症等的临床治疗.丁螺环酮在体内代谢活化为6-羟基丁螺环酮，并发挥药理功能，研究显示(R)-6-羟基丁螺环酮与(S)-6-羟基丁螺环酮在药效、药物代谢动力学与毒副作用方面并无明显差异，6-羟基丁螺环酮成为潜在的抗抑郁药物.Patel等[98]从150余株菌株中筛选到含羰基还原酶Rhizopus stolonifer SC 13898细胞，催化6-酮丁螺环酮不对称还原合成(S)-6-羟基丁螺环酮，产率达53%，e.e.>96.6%.同时筛选到的Candida maltose SC 16112可催化制备(R)-6-羟基丁螺环酮，产率大于57%，e.e.>97%.Goldberg等[99]从Hansenula polymorpha SC 13845中筛选得到一株NADPH依赖性羰基还原酶，与来源于Saccharomyces cerevisiae的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶重组共表达后，可催化50g/L 6-酮丁螺环酮还原制备(R)-6-羟基丁螺环酮，产率与e.e.值均达99%以上.另外一株来源于Pseudomonas putida SC 16269的羰基还原酶，可在相同底物浓度下催化制备(S)-6-羟基丁螺环酮，产率>98%，e.e.>96.9%. ...
Enantioselective bioreduction of ethyl 4,4,4-trihalide-3-oxobutanoate by Kluyveromyces marxianus
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2013
... 贝氟沙通（Befloxatone），化学名5(R)-(甲氧甲基)-3-[4-[4,4,4-三氟基-3(R)-羟基丁氧基]苯基]-2-唑烷酮，是一种唑烷酮衍生物，可选择竞争性抑制人体内单胺氧化A（MAO-A），阻止脑内5-羟色胺和去甲肾上腺素降解，同时增加脑内突触间隙5-羟色胺和去甲肾上腺素的浓度，起到强效抗抑郁作用[93].4,4,4-三氟乙酰乙酸乙酯（EOTB）不对称还原制备(R)-4,4,4-三氟-3-羟基丁酸乙酯[(R)-EHTB]为贝氟沙通合成的关键步骤.Zhang等[94]首次利用含NADPH依赖型羰基还原酶与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（GPDH）的Bacillus pumilus Phe-C3细胞催化EOTB合成(R)-EHTB，底物浓度为60mmol/L， 产率为67%，e.e.达95%（图9）.He等[95]利用Saccharomyces uvarum SW-58全细胞为催化剂，构建水-有机两相反应体系，底物EOTB浓度0.2mmol/L，反应4h，转化率达85%，产物e.e.为85.2%.含羰基还原酶的Kluyveromyces marxianus细胞也被应用于(R)-EHTB的合成，但产物产率与e.e.值均较低[96].Kara等[97]最近利用来源于Lactobacillus kefir的ADH evo-1.1.200在无水介质中催化该反应，底物浓度5mmol/L，反应24h，转化率为39.2%，选择性明显提高（e.e.>99.9%）. ...
Bioreductions catalyzed by an alcohol dehydrogenase in non-aqueous media
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2014
... 贝氟沙通（Befloxatone），化学名5(R)-(甲氧甲基)-3-[4-[4,4,4-三氟基-3(R)-羟基丁氧基]苯基]-2-唑烷酮，是一种唑烷酮衍生物，可选择竞争性抑制人体内单胺氧化A（MAO-A），阻止脑内5-羟色胺和去甲肾上腺素降解，同时增加脑内突触间隙5-羟色胺和去甲肾上腺素的浓度，起到强效抗抑郁作用[93].4,4,4-三氟乙酰乙酸乙酯（EOTB）不对称还原制备(R)-4,4,4-三氟-3-羟基丁酸乙酯[(R)-EHTB]为贝氟沙通合成的关键步骤.Zhang等[94]首次利用含NADPH依赖型羰基还原酶与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（GPDH）的Bacillus pumilus Phe-C3细胞催化EOTB合成(R)-EHTB，底物浓度为60mmol/L， 产率为67%，e.e.达95%（图9）.He等[95]利用Saccharomyces uvarum SW-58全细胞为催化剂，构建水-有机两相反应体系，底物EOTB浓度0.2mmol/L，反应4h，转化率达85%，产物e.e.为85.2%.含羰基还原酶的Kluyveromyces marxianus细胞也被应用于(R)-EHTB的合成，但产物产率与e.e.值均较低[96].Kara等[97]最近利用来源于Lactobacillus kefir的ADH evo-1.1.200在无水介质中催化该反应，底物浓度5mmol/L，反应24h，转化率为39.2%，选择性明显提高（e.e.>99.9%）. ...
Enantioselective microbial reduction of 6-oxo-8-[4-[4-(2-pyrimidinyl)-1-piperazinyl]butyl]-8-azaspiro[4.5]decane-7,9-dione
1
2005
... 丁螺环酮是一种强效的5-羟色胺5HT1A受体部分激动剂，在脑中侧缝际区与5-HT1A受体高度结合，能减少体内5-羟色胺受体敏感性起到抗抑郁的作用.丁螺环酮无镇静、催眠、中枢性肌肉松弛等副作用，无成瘾性，广泛应用于抑郁症、焦虑症等的临床治疗.丁螺环酮在体内代谢活化为6-羟基丁螺环酮，并发挥药理功能，研究显示(R)-6-羟基丁螺环酮与(S)-6-羟基丁螺环酮在药效、药物代谢动力学与毒副作用方面并无明显差异，6-羟基丁螺环酮成为潜在的抗抑郁药物.Patel等[98]从150余株菌株中筛选到含羰基还原酶Rhizopus stolonifer SC 13898细胞，催化6-酮丁螺环酮不对称还原合成(S)-6-羟基丁螺环酮，产率达53%，e.e.>96.6%.同时筛选到的Candida maltose SC 16112可催化制备(R)-6-羟基丁螺环酮，产率大于57%，e.e.>97%.Goldberg等[99]从Hansenula polymorpha SC 13845中筛选得到一株NADPH依赖性羰基还原酶，与来源于Saccharomyces cerevisiae的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶重组共表达后，可催化50g/L 6-酮丁螺环酮还原制备(R)-6-羟基丁螺环酮，产率与e.e.值均达99%以上.另外一株来源于Pseudomonas putida SC 16269的羰基还原酶，可在相同底物浓度下催化制备(S)-6-羟基丁螺环酮，产率>98%，e.e.>96.9%. ...
Enantioselective microbial reduction of 6-oxo-8-[4-[4-(2-pyrimidinyl)-1-piperazinyl]butyl]-8-azaspiro [4.5] decane-7,9- dione: cloning and expression of reductases
1
2006
... 丁螺环酮是一种强效的5-羟色胺5HT1A受体部分激动剂，在脑中侧缝际区与5-HT1A受体高度结合，能减少体内5-羟色胺受体敏感性起到抗抑郁的作用.丁螺环酮无镇静、催眠、中枢性肌肉松弛等副作用，无成瘾性，广泛应用于抑郁症、焦虑症等的临床治疗.丁螺环酮在体内代谢活化为6-羟基丁螺环酮，并发挥药理功能，研究显示(R)-6-羟基丁螺环酮与(S)-6-羟基丁螺环酮在药效、药物代谢动力学与毒副作用方面并无明显差异，6-羟基丁螺环酮成为潜在的抗抑郁药物.Patel等[98]从150余株菌株中筛选到含羰基还原酶Rhizopus stolonifer SC 13898细胞，催化6-酮丁螺环酮不对称还原合成(S)-6-羟基丁螺环酮，产率达53%，e.e.>96.6%.同时筛选到的Candida maltose SC 16112可催化制备(R)-6-羟基丁螺环酮，产率大于57%，e.e.>97%.Goldberg等[99]从Hansenula polymorpha SC 13845中筛选得到一株NADPH依赖性羰基还原酶，与来源于Saccharomyces cerevisiae的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶重组共表达后，可催化50g/L 6-酮丁螺环酮还原制备(R)-6-羟基丁螺环酮，产率与e.e.值均达99%以上.另外一株来源于Pseudomonas putida SC 16269的羰基还原酶，可在相同底物浓度下催化制备(S)-6-羟基丁螺环酮，产率>98%，e.e.>96.9%. ...
Asymmetric bioreduction of a keto ester to its corresponding (S)-hydroxy ester by Microbacterium sp. MB 5614
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1996
... 孟鲁斯特（Montelukast）是第三代白三烯受体拮抗剂药物，由Merk公司开发，用于成人及儿童哮喘的预防和长期治疗，具有疗效稳定持久、安全性高、副作用少等突出优势.由2-[3-[3-[(E)-2-(7-氯-2-喳琳基)乙烯基]苯基]-3-氧代丙基]苯甲酸甲酯（酮酯M）不对称还原制备2-[3-(S)-[3-[2-(7-氯-2-喹啉基)乙烯基]苯基]-3-羟基丙基]苯甲酸甲酯[(S)-羟酯]是孟鲁司特合成的关键环节（图10）.1996年，Microbacterium sp. MB 5614被首次应用于(S)-羟酯的合成，产物e.e.>95%[100].Codexis公司基于羰基还原酶ADH进行定向进化，开发了系列突变体，催化(S)-羟酯合成效率提高了2000倍，底物浓度为100g/L时，产率为99.3%，e.e.达99.9% [101].来源于Candida albicans XP1463 (CCTCC M 2014382)的醛酮还原酶CaAKR，也对(S)-羟酯不对称合成展现出高催化活性与立体选择性，比酶活达145U/mg，产物e.e.>99%[92]. ...

(R)-(-)-3-奎宁醇含有一个含氮双环，是抗哮喘药物他沙利定、瑞伐托酯等药物合成的重要前体.不同的(R)-(-)-3-奎宁醇化学制备方法包括外消旋3-奎宁醇的动力学拆分、3-奎宁酮不对称还原等都已获报道[102-103].Chen等[104]利用奎宁酮还原酶（QNR）与葡萄糖脱氢酶（GDH）制备酶聚集体催化剂，催化3-奎宁酮不对称还原，底物浓度33g/L，反应3h，转化率达100%，产物e.e.>99.9%.该团队进一步构建了羰基还原耦联辅酶再生全细胞催化剂，催化(R)-(-)-3-奎宁醇的合成，反应速率较天然纯酶提升3倍，底物浓度达468g/L，产物 e.e.>99.9%，时空产率达1505.5g/(L·d)，均为文献报道最高值，具有良好的应用前景[105]. ...
1
... 孟鲁斯特（Montelukast）是第三代白三烯受体拮抗剂药物，由Merk公司开发，用于成人及儿童哮喘的预防和长期治疗，具有疗效稳定持久、安全性高、副作用少等突出优势.由2-[3-[3-[(E)-2-(7-氯-2-喳琳基)乙烯基]苯基]-3-氧代丙基]苯甲酸甲酯（酮酯M）不对称还原制备2-[3-(S)-[3-[2-(7-氯-2-喹啉基)乙烯基]苯基]-3-羟基丙基]苯甲酸甲酯[(S)-羟酯]是孟鲁司特合成的关键环节（图10）.1996年，Microbacterium sp. MB 5614被首次应用于(S)-羟酯的合成，产物e.e.>95%[100].Codexis公司基于羰基还原酶ADH进行定向进化，开发了系列突变体，催化(S)-羟酯合成效率提高了2000倍，底物浓度为100g/L时，产率为99.3%，e.e.达99.9% [101].来源于Candida albicans XP1463 (CCTCC M 2014382)的醛酮还原酶CaAKR，也对(S)-羟酯不对称合成展现出高催化活性与立体选择性，比酶活达145U/mg，产物e.e.>99%[92]. ...
Practical asymmetric hydrogenation of 3-quinuclidinone catalyzed by the XylSkewphos/PICA-Ruthenium() complex
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2009
... (R)-(-)-3-奎宁醇含有一个含氮双环，是抗哮喘药物他沙利定、瑞伐托酯等药物合成的重要前体.不同的(R)-(-)-3-奎宁醇化学制备方法包括外消旋3-奎宁醇的动力学拆分、3-奎宁酮不对称还原等都已获报道[102-103].Chen等[104]利用奎宁酮还原酶（QNR）与葡萄糖脱氢酶（GDH）制备酶聚集体催化剂，催化3-奎宁酮不对称还原，底物浓度33g/L，反应3h，转化率达100%，产物e.e.>99.9%.该团队进一步构建了羰基还原耦联辅酶再生全细胞催化剂，催化(R)-(-)-3-奎宁醇的合成，反应速率较天然纯酶提升3倍，底物浓度达468g/L，产物 e.e.>99.9%，时空产率达1505.5g/(L·d)，均为文献报道最高值，具有良好的应用前景[105]. ...
Stereoselective synthesis of (R)-3-quinuclidinol through asymmetric reduction of 3-quinuclidinone with 3-quinuclidinone reductase of Rhodotorula rubra
1
2009
... (R)-(-)-3-奎宁醇含有一个含氮双环，是抗哮喘药物他沙利定、瑞伐托酯等药物合成的重要前体.不同的(R)-(-)-3-奎宁醇化学制备方法包括外消旋3-奎宁醇的动力学拆分、3-奎宁酮不对称还原等都已获报道[102-103].Chen等[104]利用奎宁酮还原酶（QNR）与葡萄糖脱氢酶（GDH）制备酶聚集体催化剂，催化3-奎宁酮不对称还原，底物浓度33g/L，反应3h，转化率达100%，产物e.e.>99.9%.该团队进一步构建了羰基还原耦联辅酶再生全细胞催化剂，催化(R)-(-)-3-奎宁醇的合成，反应速率较天然纯酶提升3倍，底物浓度达468g/L，产物 e.e.>99.9%，时空产率达1505.5g/(L·d)，均为文献报道最高值，具有良好的应用前景[105]. ...
Magnetic combined cross-cinked enzyme cggregates of ketoreductase and alcohol dehydrogenase: an efficient and stable biocatalyst for asymmetric synthesis of (R)-3-quinuclidinol with regeneration of coenzymes in situ
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2018
... (R)-(-)-3-奎宁醇含有一个含氮双环，是抗哮喘药物他沙利定、瑞伐托酯等药物合成的重要前体.不同的(R)-(-)-3-奎宁醇化学制备方法包括外消旋3-奎宁醇的动力学拆分、3-奎宁酮不对称还原等都已获报道[102-103].Chen等[104]利用奎宁酮还原酶（QNR）与葡萄糖脱氢酶（GDH）制备酶聚集体催化剂，催化3-奎宁酮不对称还原，底物浓度33g/L，反应3h，转化率达100%，产物e.e.>99.9%.该团队进一步构建了羰基还原耦联辅酶再生全细胞催化剂，催化(R)-(-)-3-奎宁醇的合成，反应速率较天然纯酶提升3倍，底物浓度达468g/L，产物 e.e.>99.9%，时空产率达1505.5g/(L·d)，均为文献报道最高值，具有良好的应用前景[105]. ...

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