重组大肠杆菌1,2,4-丁三醇合成途径的平衡优化

doi:10.16085/j.issn.1000-6613.2022-0459

摘要/Abstract

摘要：

1,2,4-丁三醇（1,2,4-butantriol，BT）属于非天然化学品，是军工材料1,2,4-丁三醇三硝酸酯的前体。在重组大肠杆菌中，木糖经脱氢、脱水、脱羧和还原合成BT。但途径各反应不平衡使得中间代谢物积累限制菌体生长和产物合成。本研究首先通过CRISPR/Cas9敲除基因yjhG和yqhD构建无本底表达宿主菌，随后利用不同启动子组合调节BT合成途径中基因xdh、yjhG和yqhD的表达。结果发现，以P _inv 表达醇脱氢酶基因yqhD使BT产量达到14.4g/L；以P _tac 表达脱氢酶基因xdh和P _rrnH_P1表达脱水酶基因yjhG的组合方式，BT产量达到15.6g/L，比对照菌株KXW3009分别增加5.9%和14.7%。本研究通过对中间代谢物木糖酸合成和代谢的组合优化，促进了BT的合成，为后续研究提供了借鉴。

关键词: 1,2,4-丁三醇, 大肠杆菌, 启动子, 途径平衡

Abstract:

1,2,4-Butantriol (BT) is a non-natural chemical product, which is the precursor of 1,2,4-butantriol trinitrate of military materials. In recombinant E. coli, BT was synthesized from xylose by dehydrogenation, dehydration, decarboxylation and reduction. However, the unbalanced reactions of the pathways lead to the accumulation of intermediate metabolites, which limits bacterial growth and product synthesis. In this study, CRISPR/Cas9 was used to knock out genes yjhG and yqhD to construct a backgroundless expression host bacteria, and then different promoter combinations were used to regulate the expression of genes xdh, yjhG and yqhD in the BT synthesis pathway. It was found that expression of the alcohol dehydrogenase gene yqhD with P _inv resulted in BT yield of 14.4g/L and the combination of dehydrogenase gene xdh expressed by P _tac and dehydrase gene yjhG expressed by P _rrnH_P1 made BT yield reach 15.6g/L, which was 5.9% and 14.7% higher than that of the control strain KXW3009, respectively. This study facilitated the synthesis of BT through the regulation of upstream and downstream gene expression of intermediate metabolites, which provides a reference for subsequent studies.

Key words: 1,2,4-butanetriol, Escherichia coli, promoter, balance pathway

中图分类号:

郭超, 冯奥, 陆信曜, 宗红, 诸葛斌. 重组大肠杆菌1,2,4-丁三醇合成途径的平衡优化[J]. 化工进展, 2022, 41(12): 6531-6539.

GUO Chao, FENG Ao, LU Xinyao, ZONG Hong, ZHUGE Bin. Balanced optimization of the 1,2,4-butanetriol synthesis pathway in recombinant Escherichia coli[J]. Chemical Industry and Engineering Progress, 2022, 41(12): 6531-6539.

图/表 9

参考文献 26

1	NIU W, MOLEFE M N, FROST J W. Microbial synthesis of the energetic material precursor 1,2,4-butanetriol[J]. Journal of the American Chemical Society, 2003, 125(43): 12998-12999.
2	REN T, LIU D X. Synthesis of cationic lipids from 1, 2, 4-butanetriol[J]. Tetrahedron Letters, 1999, 40(2): 209-212.
3	景培源. 多策略强化1,2,4-丁三醇的生物合成[D]. 无锡: 江南大学, 2018.
	JING Peiyuan. Enhanced 1,2,4-butanetriol bioproduction by muti-strategy [D]. Wuxi: Jiangnan University, 2018.
4	何姝颖, 诸葛斌, 陆信曜, 等. 副产物途径的缺失对大肠杆菌合成D-1, 2, 4-丁三醇的影响[J]. 微生物学通报, 2017, 44(1): 30-37.
	HE S Y, ZHUGE B, LU X Y, et al. Influence of the deficiency of by-product pathways on biosynthesis of D-1,2,4-butanetriol in Escherichia coli [J]. Microbiology China, 2017, 44(1): 30-37.
5	祖金珊, 徐世文, 陆信曜, 等. 整合型1, 2, 4-丁三醇重组菌的构建及共底物发酵[J]. 应用与环境生物学报, 2019, 25(4): 966-971.
	ZU J S, XU S W, LU X Y, et al. Construction of a 1, 2, 4-butanetriol-integrated strain and fermentation of its co-substrate[J]. Chinese Journal of Applied and Environmental Biology, 2019, 25(4): 966-971.
6	VALDEHUESA K N G, LIU H W, RAMOS K R M, et al. Direct bioconversion of d-xylose to 1, 2, 4-butanetriol in an engineered Escherichia coli [J]. Process Biochemistry, 2014, 49(1): 25-32.
7	孙雷, 杨帆, 朱泰承, 等. 大肠杆菌合成1,2,4-丁三醇的途径优化[J]. 生物工程学报, 2016, 32(1): 51-63.
	SUN L, YANG F, ZHU T C, et al. Optimization of 1,2,4-butanetriol synthetic pathway in Escherichia coli [J]. Chinese Journal of Biotechnology, 2016, 32(1): 51-63.
8	ZHOU S H, YUAN S F, NAIR P H, et al. Development of a growth coupled and multi-layered dynamic regulation network balancing malonyl-CoA node to enhance (2S)-naringenin biosynthesis in Escherichia coli [J]. Metabolic Engineering, 2021, 67: 41-52.
9	CABULONG R B, VALDEHUESA K N G, RAMOS K R M, et al. Enhanced yield of ethylene glycol production from D-xylose by pathway optimization in Escherichia coli [J]. Enzyme and Microbial Technology, 2017, 97: 11-20.
10	MA Q, XIA L, WU H Y, et al. Metabolic engineering of Escherichia coli for efficient osmotic stress-free production of compatible solute hydroxyectoine[J]. Biotechnology and Bioengineering, 2022, 119(1): 89-101.
11	HOU J S, GAO C, GUO L, et al. Rewiring carbon flux in Escherichia coli using a bifunctional molecular switch[J]. Metabolic Engineering, 2020, 61: 47-57.
12	GAO C, HOU J S, XU P, et al. Programmable biomolecular switches for rewiring flux in Escherichia coli [J]. Nature Communications, 2019, 10(1): 3751.
13	韦宇拓, 黄日波, 杜丽琴.一个在大肠杆菌中组成型表达的启动子及其在大肠杆菌中的应用: CN101560516B[P]. 1970-01-16.
	WEI Y T, HUANG R B, DU L Q. Constitutive expression promoter in Escherichia coli and applications in Escherichia coli : CN101560516B[P]. 1970-01-16.
14	周景文, 陈坚, 周胜虎, 等. 一种大肠杆菌高强度组合启动子及其应用: CN106591310B[P]. 2019-10-25.
	ZHOU J W, CHEN J, ZHOU S H, et al. Escherichia coli high-strength combined promoters and application thereof: CN106591310B[P]. 2019-10-25.
15	MAEDA M, SHIMADA T, ISHIHAMA A. Strength and regulation of seven rRNA promoters in Escherichia coli [J]. PLoS One, 2015, 10(12): e0144697.
16	狄莹莹, 王昕钰, 冯奥, 等. 大肠杆菌乙酸弱化对1,2,4-丁三醇合成的影响[J].食品与发酵工业, 2021, 47(19): 29-34.
	DI Y Y, WANG X Y, FENG A, et al. Improved 1,2,4-butanetriol production by weaken acetate pathway in a recombinant Escherichia coli [J]. Food and Fermentation Industries, 2021, 47(19): 29-34.
17	ATSUMI S, WU T Y, ECKL E M, et al. Engineering the isobutanol biosynthetic pathway in Escherichia coli by comparison of three aldehyde reductase/alcohol dehydrogenase genes[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2010, 85(3): 651-657.
18	朱晓, 邹琪琪, 张锋. 拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)NRRL-B593在三种不同培养基中乙醇脱氢酶活力的测定[J]. 科技风, 2018(15): 130-131.
	ZHU X, ZOU Q Q, ZHANG F. Determination of alcohol dehydrogenase activities in Clostridium beijerinckii grown on various substrates[J]. Technology Wind, 2018(15): 130-131.
19	ZHANG Y P, GUO S T, WANG Y X, et al. Production of D-xylonate from corn cob hydrolysate by a metabolically engineered Escherichia coli strain[J]. ACS Sustainable Chemistry & Engineering, 2019, 7(2): 2160-2168.
20	VALDEHUESA K N G, LEE W K, RAMOS K R M, et al. Identification of aldehyde reductase catalyzing the terminal step for conversion of xylose to butanetriol in engineered Escherichia coli [J]. Bioprocess and Biosystems Engineering, 2015, 38(9): 1761-1772.
21	SUN L, YANG F, SUN H B, et al. Synthetic pathway optimization for improved 1,2,4-butanetriol production[J]. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, 2016, 43(1): 67-78.
22	ZHANG N N, WANG J B, ZHANG Y, et al. Metabolic pathway optimization for biosynthesis of 1,2,4-butanetriol from xylose by engineered Escherichia coli [J]. Enzyme and Microbial Technology, 2016, 93/94: 51-58.
23	祖金珊. 整合型1,2,4-丁三醇合成菌株的构建及发酵条件优化[D]. 无锡: 江南大学, 2019.
	ZU J S. Construction of integrated 1,2,4-butanetriol synthesis strain and optimization of fermentation conditions[D]. Wuxi: Jiangnan University, 2019.
24	TOIVARI M, VEHKOMÄKI M L, NYGÅRD Y, et al. Low pH D-xylonate production with Pichia kudriavzevii [J]. Bioresource Technology, 2013, 133: 555-562.
25	ANGLÈS F, CASTANIÉ-CORNET M P, SLAMA N, et al. Multilevel interaction of the DnaK/DnaJ(HSP70/HSP40) stress-responsive chaperone machine with the central metabolism[J]. Scientific Reports, 2017, 7: 41341.
26	DARIUSHNEJAD H, FARAJNIA S, ZARGHAMI N, et al. Effect of DnaK/DnaJ/GrpE and DsbC chaperons on periplasmic expression of Fab antibody by E. coli SEC pathway[J]. International Journal of Peptide Research and Therapeutics, 2019, 25(1): 67-74.

菌株和质粒	相关特性	来源
E.coli W3009（W3009）	E.coli W3110 ΔxylABΔyagEΔyjhHΔptsHIΔmgsA	实验室保存
E.coli W3010（W3010）	E.coli W3009 ΔyjhGΔyqhD	本研究
E.coli KXW3009（KXW3009）	E.coli W3009，pEtac-kivD-tac-xdh	实验室保存
E.coli KXW3010（KXW3010）	E.coli W3010，pEtac-kivD-tac-xdh	本研究
E.coli KXW3010P0（P0）	E.coli KXW3010，pRSFDuet-P _yjhG -yjhG	本研究
E.coli KXW3010P1（P1）	E.coli KXW3010，pRSFDuet-P _yjhG -yjhG-P _yqhD-yqhD	本研究
E.coli KXW3010P2（P2）	E.coli KXW3010，pRSFDuet-P _yjhG -yjhG-tac-yqhD	本研究
E.coli KXW3010P3（P3）	E.coli KXW3010，pRSFDuet-P _yjhG -yjhG-inv-yqhD	本研究
E.coli KXW3010P4（P4）	E.coli KXW3010，pRSFDuet-P _yjhG -yjhG-dnaKJ-yqhD	本研究
E.coli KXW3010P5（P5）	E.coli KXW3010，pRSFDuet-P _yjhG -yjhG-grpE-yqhD	本研究
E.coli KXW3010P3-12（P12）	E.coli W3010，pRSF-P _yjhG -yjhG-inv-yqhD，pEtac-kivD-rpsA P1-xdh	本研究
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E.coli KXW3010P3-14（P14）	E.coli W3010，pRSF-P _yjhG -yjhG-inv-yqhD，pEtac-kivD-inv-xdh	本研究
E.coli KXW3010P3-15（P15）	E.coli W3010，pRSF-P _yjhG -yjhG-inv-yqhD，pEtac-kivD-dnaKJ-xdh	本研究
E.coli KXW3010P3-16（P16）	E.coli W3010，pRSF-P _yjhG -yjhG-inv-yqhD，pEtac-kivD-grpE-xdh	本研究
E.coli KXW3010P3-21（P21）	E.coli W3010，pRSFtac-yjhG-inv-yqhD，pEtac-kivD-tac-xdh	本研究
E.coli KXW3010P3-22（P22）	E.coli W3010，pRSFtac-yjhG-inv-yqhD，pEtac-kivD-rpsA P1-xdh	本研究
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E.coli KXW3010P3-25（P25）	E.coli W3010，pRSFtac-yjhG-inv-yqhD，pEtac-kivD-dnaKJ-xdh	本研究
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E.coli KXW3010P3-46（P46）	E.coli W3010，pRSFrrnH P1-yjhG-inv-yqhD，pEtac-kivD-grpE-xdh	本研究
E.coli KXW3010P3-51（P51）	E.coli W3010，pRSFdnaKJrpsT -yjhG-inv-yqhD，pEtac-kivD-tac-xdh	本研究
E.coli KXW3010P3-52（P52）	E.coli W3010，pRSFdnaKJrpsT -yjhG-inv-yqhD，pEtac-kivD-rpsA P1-xdh	本研究
E.coli KXW3010P3-53（P53）	E.coli W3010，pRSFdnaKJrpsT -yjhG-inv-yqhD，pEtac-kivD-rpsT P1-xdh	本研究
E.coli KXW3010P3-54（P54）	E.coli W3010，pRSFdnaKJrpsT -yjhG-inv-yqhD，pEtac-kivD-inv-xdh	本研究
E.coli KXW3010P3-55（P55）	E.coli W3010，pRSFdnaKJrpsT -yjhG-inv-yqhD，pEtac-kivD-dnaKJ-xdh	本研究
E.coli KXW3010P3-56（P56）	E.coli W3010，pRSFdnaKJrpsT -yjhG-inv-yqhD，pEtac-kivD-grpE-xdh	本研究
pCas9	P-cas9， Kan^r	实验室保存
pTargetF-PMB	pTarget added sgRNA， Spe^r	实验室保存
pEtac-kivD-tac-xdh	Kan^r， tac启动子	实验室保存

菌株和质粒	相关特性	来源
E.coli W3009（W3009）	E.coli W3110 ΔxylABΔyagEΔyjhHΔptsHIΔmgsA	实验室保存
E.coli W3010（W3010）	E.coli W3009 ΔyjhGΔyqhD	本研究
E.coli KXW3009（KXW3009）	E.coli W3009，pEtac-kivD-tac-xdh	实验室保存
E.coli KXW3010（KXW3010）	E.coli W3010，pEtac-kivD-tac-xdh	本研究
E.coli KXW3010P0（P0）	E.coli KXW3010，pRSFDuet-P _yjhG -yjhG	本研究
E.coli KXW3010P1（P1）	E.coli KXW3010，pRSFDuet-P _yjhG -yjhG-P _yqhD-yqhD	本研究
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E.coli KXW3010P5（P5）	E.coli KXW3010，pRSFDuet-P _yjhG -yjhG-grpE-yqhD	本研究
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E.coli KXW3010P3-13（P13）	E.coli W3010，pRSF-P _yjhG -yjhG-inv-yqhD，pEtac-kivD-rpsT P1-xdh	本研究
E.coli KXW3010P3-14（P14）	E.coli W3010，pRSF-P _yjhG -yjhG-inv-yqhD，pEtac-kivD-inv-xdh	本研究
E.coli KXW3010P3-15（P15）	E.coli W3010，pRSF-P _yjhG -yjhG-inv-yqhD，pEtac-kivD-dnaKJ-xdh	本研究
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E.coli KXW3010P3-34（P34）	E.coli W3010，pRSFrrnC P1-yjhG-inv-yqhD，pEtac-kivD-inv-xdh	本研究
E.coli KXW3010P3-35（P35）	E.coli W3010，pRSFrrnC P1-yjhG-inv-yqhD，pEtac-kivD-dnaKJ-xdh	本研究
E.coli KXW3010P3-36（P36）	E.coli W3010，pRSFrrnC P1-yjhG-inv-yqhD，pEtac-kivD-grpE-xdh	本研究
E.coli KXW3010P3-41（P41）	E.coli W3010，pRSFrrnH P1-yjhG-inv-yqhD，pEtac-kivD-tac-xdh	本研究
E.coli KXW3010P3-42（P42）	E.coli W3010，pRSFrrnH P1-yjhG-inv-yqhD，pEtac-kivD-rpsA P1-xdh	本研究
E.coli KXW3010P3-43（P43）	E.coli W3010，pRSFrrnH P1-yjhG-inv-yqhD，pEtac-kivD-rpsT P1-xdh	本研究
E.coli KXW3010P3-44（P44）	E.coli W3010，pRSFrrnH P1-yjhG-inv-yqhD，pEtac-kivD-inv-xdh	本研究
E.coli KXW3010P3-45（P45）	E.coli W3010，pRSFrrnH P1-yjhG-inv-yqhD，pEtac-kivD-dnaKJ-xdh	本研究
E.coli KXW3010P3-46（P46）	E.coli W3010，pRSFrrnH P1-yjhG-inv-yqhD，pEtac-kivD-grpE-xdh	本研究
E.coli KXW3010P3-51（P51）	E.coli W3010，pRSFdnaKJrpsT -yjhG-inv-yqhD，pEtac-kivD-tac-xdh	本研究
E.coli KXW3010P3-52（P52）	E.coli W3010，pRSFdnaKJrpsT -yjhG-inv-yqhD，pEtac-kivD-rpsA P1-xdh	本研究
E.coli KXW3010P3-53（P53）	E.coli W3010，pRSFdnaKJrpsT -yjhG-inv-yqhD，pEtac-kivD-rpsT P1-xdh	本研究
E.coli KXW3010P3-54（P54）	E.coli W3010，pRSFdnaKJrpsT -yjhG-inv-yqhD，pEtac-kivD-inv-xdh	本研究
E.coli KXW3010P3-55（P55）	E.coli W3010，pRSFdnaKJrpsT -yjhG-inv-yqhD，pEtac-kivD-dnaKJ-xdh	本研究
E.coli KXW3010P3-56（P56）	E.coli W3010，pRSFdnaKJrpsT -yjhG-inv-yqhD，pEtac-kivD-grpE-xdh	本研究
pCas9	P-cas9， Kan^r	实验室保存
pTargetF-PMB	pTarget added sgRNA， Spe^r	实验室保存
pEtac-kivD-tac-xdh	Kan^r， tac启动子	实验室保存

引物名称	引物序列（5′→3′）	质粒构建或功能
Sg-yjhG-F	tcaaaaaggcatcaccacccGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTC	pTargetF-PMB（yjhG）
Sg-yjhG-R	gggtggtgatgcctttttgaACTAGTATTATACCTAGGACTGAGCTAGCTGTCAAG
Sg-yqhD-F	gtgatctcccgtaaaaccacGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTC	pTargetF-PMB（yqhD）
Sg-yqhD-R	gtggttttacgggagatcacACTAGTATTATACCTAGGACTGAGCTAGCTGTCAAG
dornor-yjhG-F	TGGCGGGAGATCGCCAGAGCTTCCGCGCGAGCTGCGCTGAACCTATATTGCGCC	融合片段dornor（yjhG）
dornor-yjhG-R	TCAATGGCGGTGGATTTGATCACCGAACCTTCTGGCGCAATATAGGTTCAGCGCAG
dornor-yqhD-F	TGTGTGCTGACGCTGCCAGCAACCGGTTCAGAATCCAACGCAGGCATCACTGAAGG	融合片段dornor（yqhD）
dornor-yqhD-R	GGCAATCGCGGCGTCAATACGCTCATCATCGGAACCTTCAGTGATGCCTGCGTTGG
yjhG-F	aatttcacacaggaaacaGTGATCCTGTACAACTTTCCGG	pRSFDuet-P _yjhG -yjhG
yjhG-R	cctgcaggcgcgccgGGTACCAGAAGAATTAAACCGACTTCG
yqhD-F	cggcgcgcctgcaggGTCCATCAACAGTTCCTGTAACTGC	pRSFDuet-P _yjhG -yjhG-P _yqhD-yqhD
yqhD-R	tcgacttaagcattatgcAGTGGTGATGAACAGTTCTTCTCTG
tac-yqhD-F	cggcgcgcctgcaggGAGGGAGCTTATCGACTGCACGG	pRSFDuet-P _yjhG -yjhG-tac-yqhD
tac-yqhD-R	TGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCAC
yqhD-tac-F	aatttcacacaggaaacaGAAGTAATGAACAACTTTAATCTGCACACCCC
yqhD-tac-R	tcgacttaagcattatgcGAGGCGTAAAAAGCTTAGCGGGC
inv-yqhD-F	cggcgcgcctgcaggAACATTGAGGCAACGACAAGGTCGATTCTGCTATCCTTG AGGAGGCTCCTCGTAATGAACAACTTTAATCTGCACACCCC	pRSF-P _yjhG -yjhG-inv-yqhD
inv-yqhD-R	tcgacttaagcattatgcGAGGCGTAAAAAGCTTAGCGGGC
dnaKJ-yqhD-F	cggcgcgcctgcaggCAGGAAACATTTTTTGATGAATGCCTTGGC	pRSFDuet-P _yjhG -yjhG-dnaKJ-yqhD
dnaKJ-yqhD-R	CTAAACGTCTCCACTATATATTCGGTCATCATGTGG
yqhD-dnaKJ-F	cgaatatatagtggagacgtttagGTAATGAACAACTTTAATCTGCACACCCCAACC
yqhD-dnaKJ-R	tcgacttaagcattatgcGAGGCGTAAAAAGCTTAGCGGGC
grpE-yqhD-F	cggcgcgcctgcaggGCCTTCCAGCACATCGGCTAACTGTTGC	pRSFDuet-P _yjhG -yjhG-grpE-yqhD
grpE-yqhD-R	GAATTTCTCCGCGTTTTTTTCGCATTCATCTC
yqhD-grpE-F	gaaaaaaacgcggagaaattcGTAATGAACAACTTTAATCTGCACACCCCAACC
yqhD-grpE-R	tcgacttaagcattatgcGAGGCGTAAAAAGCTTAGCGGGC
rpsA P1-xdh-F	aaatcataagcggccgcaTGAAAATTTTCCTTGACGCCTCCTCGG	pEtac-kivD-rpsA P1-xdh
rpsA P1-xdh-R	gggatagatggctgaggacatgaaTTTGATCTCGGCCAAAAGGCGC
xdh-rpsA P1-F	gccgagatcaaaTTCATGTCCTCAGCCATCTATCCCCAGCTG
xdh-rpsA P1-R	tttgttagcagccggatcTCAACGCCAGCCGGCGTC
rpsT P1-xdh-F	aaatcataagcggccgcaTCATTGCCATGGCGCAAATCACGG	pEtac-kivD-rpsT P1-xdh
rpsT P1-xdh-R	ggatagatggctgaggacatgaaACTCGTTACGTAGTGATGGCGCAG
xdh-rpsT P1-F	tacgtaacgagtTTCATGTCCTCAGCCATCTATCCCCAGCTG
xdh-rpsT P1-R	tttgttagcagccggatcTCAACGCCAGCCGGCGTC
inv-xdh-F	taagcggccgcaAACATTGAGGCAACGACAAGGTCGATTCTGCTATCCTTG AGGAGGCTCCTCTTCATGTCCTCAGCCATCTATCCC	pEtac-kivD-inv-xdh
inv-xdh-R	tttgttagcagccggatcTCAACGCCAGCCGGCGTC
dnaKJ-xdh-F	aaatcataagcggccgcaTTTTTTGATGAATGCCTTGGCTGCGATTCATTC	pEtac-kivD-dnaKJ-xdh
dnaKJ-xdh-R	CTAAACGTCTCCACTATATATTCGGTCATCATGTGGTTG
xdh-dnaKJ-F	cgaatatatagtggagacgtttagGAATTCATGTCCTCAGCCATCTATCCCCAG
xdh-dnaKJ-R	tttgttagcagccggatcTCAACGCCAGCCGGCGTC
grpE-xdh-F	aaatcataagcggccgcaAACGTTTCTCGCTGATGTAGTGGCC	pEtac-kivD-grpE-xdh
grpE-xdh-R	GAATTTCTCCGCGTTTTTTTCGCATTCATCTCG
xdh-grpE-F	gaaaaaaacgcggagaaattcTTCATGTCCTCAGCCATCTATCCCCAGC
xdh-grpE-R	tttgttagcagccggatcTCAACGCCAGCCGGCGTC
rrnC P1-yjhG-F	aatttcacacaggaaacaCTTAAAGGCATTACTTATCTTCCTTTTTCTTTTTATTCCTCC	pRSFrrnC P1-yjhG-inv-yqhD
rrnC P1-yjhG-R	gcaaaaatattgcgaacagacatgagTGGTGGCGCATTATAGGGAGTTATTCC
yjhG-rrnC P-F	aatgcgccaccaCTCATGTCTGTTCGCAATATTTTTGCTGACG
yjhG-rrnC P1-R	cctgcaggcgcgccgCTTTCAGTTTTTATTCATAAAATCGCGCAAAGCC
rrnH P1-yjhG-F	aatttcacacaggaaacaAAAGTGCTGGTGCGTACGGG	pRSFrrnH P1-yjhG-inv-yqhD
rrnH P1-yjhG-R	caaaaatattgcgaacagacatgagTGGAGGCGCATTATAGGGAGTCGG
yjhG-rrnH P-F	gcgcctccaCTCATGTCTGTTCGCAATATTTTTGCTGACG
yjhG-rrnH P-R	cctgcaggcgcgccgCTTTCAGTTTTTATTCATAAAATCGCGCAAAGCC
tac-yjhG-F	aatttcacacaggaaacaGGAGCTTATCGACTGCACGGTGC	pRSFtac-yjhG-inv-yqhD
tac-yjhG-R	TGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTC
yjhG-tac-F	gataacaatttcacacaggaaacaCTCATGTCTGTTCGCAATATTTTTGCTGACGAG
yjhG-tac-R	cctgcaggcgcgccgCTTTCAGTTTTTATTCATAAAATCGCGCAAAGCC
dnaKJ-rpsT-F	aatttcacacaggaaacaGCACAAAAAATTTTTGCATCTCCCCC	pRSFdnaKJrpsT-yjhG-inv-yqhD
dnaKJ-rpsT-R	ttacgtagtgatggtATTCGGTCATCATGTGGTTGTGAG
rpsT-dnaKJ-F	ccacatgatgaccgaatACCATCACTACGTAACGAGTGCC
rpsT-dnaKJ-R	caaaaatattgcgaacagacatgagGGTCCAACTCCCAAATGTGTTCTATATGG
yjhG-KJT-F	agttggaccCTCATGTCTGTTCGCAATATTTTTGCTGACG
yjhG-KJT-R	cctgcaggcgcgccgCTTTCAGTTTTTATTCATAAAATCGCGCAAAGCC

引物名称	引物序列（5′→3′）	质粒构建或功能
Sg-yjhG-F	tcaaaaaggcatcaccacccGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTC	pTargetF-PMB（yjhG）
Sg-yjhG-R	gggtggtgatgcctttttgaACTAGTATTATACCTAGGACTGAGCTAGCTGTCAAG
Sg-yqhD-F	gtgatctcccgtaaaaccacGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTC	pTargetF-PMB（yqhD）
Sg-yqhD-R	gtggttttacgggagatcacACTAGTATTATACCTAGGACTGAGCTAGCTGTCAAG
dornor-yjhG-F	TGGCGGGAGATCGCCAGAGCTTCCGCGCGAGCTGCGCTGAACCTATATTGCGCC	融合片段dornor（yjhG）
dornor-yjhG-R	TCAATGGCGGTGGATTTGATCACCGAACCTTCTGGCGCAATATAGGTTCAGCGCAG
dornor-yqhD-F	TGTGTGCTGACGCTGCCAGCAACCGGTTCAGAATCCAACGCAGGCATCACTGAAGG	融合片段dornor（yqhD）
dornor-yqhD-R	GGCAATCGCGGCGTCAATACGCTCATCATCGGAACCTTCAGTGATGCCTGCGTTGG
yjhG-F	aatttcacacaggaaacaGTGATCCTGTACAACTTTCCGG	pRSFDuet-P _yjhG -yjhG
yjhG-R	cctgcaggcgcgccgGGTACCAGAAGAATTAAACCGACTTCG
yqhD-F	cggcgcgcctgcaggGTCCATCAACAGTTCCTGTAACTGC	pRSFDuet-P _yjhG -yjhG-P _yqhD-yqhD
yqhD-R	tcgacttaagcattatgcAGTGGTGATGAACAGTTCTTCTCTG
tac-yqhD-F	cggcgcgcctgcaggGAGGGAGCTTATCGACTGCACGG	pRSFDuet-P _yjhG -yjhG-tac-yqhD
tac-yqhD-R	TGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCAC
yqhD-tac-F	aatttcacacaggaaacaGAAGTAATGAACAACTTTAATCTGCACACCCC
yqhD-tac-R	tcgacttaagcattatgcGAGGCGTAAAAAGCTTAGCGGGC
inv-yqhD-F	cggcgcgcctgcaggAACATTGAGGCAACGACAAGGTCGATTCTGCTATCCTTG AGGAGGCTCCTCGTAATGAACAACTTTAATCTGCACACCCC	pRSF-P _yjhG -yjhG-inv-yqhD
inv-yqhD-R	tcgacttaagcattatgcGAGGCGTAAAAAGCTTAGCGGGC
dnaKJ-yqhD-F	cggcgcgcctgcaggCAGGAAACATTTTTTGATGAATGCCTTGGC	pRSFDuet-P _yjhG -yjhG-dnaKJ-yqhD
dnaKJ-yqhD-R	CTAAACGTCTCCACTATATATTCGGTCATCATGTGG
yqhD-dnaKJ-F	cgaatatatagtggagacgtttagGTAATGAACAACTTTAATCTGCACACCCCAACC
yqhD-dnaKJ-R	tcgacttaagcattatgcGAGGCGTAAAAAGCTTAGCGGGC
grpE-yqhD-F	cggcgcgcctgcaggGCCTTCCAGCACATCGGCTAACTGTTGC	pRSFDuet-P _yjhG -yjhG-grpE-yqhD
grpE-yqhD-R	GAATTTCTCCGCGTTTTTTTCGCATTCATCTC
yqhD-grpE-F	gaaaaaaacgcggagaaattcGTAATGAACAACTTTAATCTGCACACCCCAACC
yqhD-grpE-R	tcgacttaagcattatgcGAGGCGTAAAAAGCTTAGCGGGC
rpsA P1-xdh-F	aaatcataagcggccgcaTGAAAATTTTCCTTGACGCCTCCTCGG	pEtac-kivD-rpsA P1-xdh
rpsA P1-xdh-R	gggatagatggctgaggacatgaaTTTGATCTCGGCCAAAAGGCGC
xdh-rpsA P1-F	gccgagatcaaaTTCATGTCCTCAGCCATCTATCCCCAGCTG
xdh-rpsA P1-R	tttgttagcagccggatcTCAACGCCAGCCGGCGTC
rpsT P1-xdh-F	aaatcataagcggccgcaTCATTGCCATGGCGCAAATCACGG	pEtac-kivD-rpsT P1-xdh
rpsT P1-xdh-R	ggatagatggctgaggacatgaaACTCGTTACGTAGTGATGGCGCAG
xdh-rpsT P1-F	tacgtaacgagtTTCATGTCCTCAGCCATCTATCCCCAGCTG
xdh-rpsT P1-R	tttgttagcagccggatcTCAACGCCAGCCGGCGTC
inv-xdh-F	taagcggccgcaAACATTGAGGCAACGACAAGGTCGATTCTGCTATCCTTG AGGAGGCTCCTCTTCATGTCCTCAGCCATCTATCCC	pEtac-kivD-inv-xdh
inv-xdh-R	tttgttagcagccggatcTCAACGCCAGCCGGCGTC
dnaKJ-xdh-F	aaatcataagcggccgcaTTTTTTGATGAATGCCTTGGCTGCGATTCATTC	pEtac-kivD-dnaKJ-xdh
dnaKJ-xdh-R	CTAAACGTCTCCACTATATATTCGGTCATCATGTGGTTG
xdh-dnaKJ-F	cgaatatatagtggagacgtttagGAATTCATGTCCTCAGCCATCTATCCCCAG
xdh-dnaKJ-R	tttgttagcagccggatcTCAACGCCAGCCGGCGTC
grpE-xdh-F	aaatcataagcggccgcaAACGTTTCTCGCTGATGTAGTGGCC	pEtac-kivD-grpE-xdh
grpE-xdh-R	GAATTTCTCCGCGTTTTTTTCGCATTCATCTCG
xdh-grpE-F	gaaaaaaacgcggagaaattcTTCATGTCCTCAGCCATCTATCCCCAGC
xdh-grpE-R	tttgttagcagccggatcTCAACGCCAGCCGGCGTC
rrnC P1-yjhG-F	aatttcacacaggaaacaCTTAAAGGCATTACTTATCTTCCTTTTTCTTTTTATTCCTCC	pRSFrrnC P1-yjhG-inv-yqhD
rrnC P1-yjhG-R	gcaaaaatattgcgaacagacatgagTGGTGGCGCATTATAGGGAGTTATTCC
yjhG-rrnC P-F	aatgcgccaccaCTCATGTCTGTTCGCAATATTTTTGCTGACG
yjhG-rrnC P1-R	cctgcaggcgcgccgCTTTCAGTTTTTATTCATAAAATCGCGCAAAGCC
rrnH P1-yjhG-F	aatttcacacaggaaacaAAAGTGCTGGTGCGTACGGG	pRSFrrnH P1-yjhG-inv-yqhD
rrnH P1-yjhG-R	caaaaatattgcgaacagacatgagTGGAGGCGCATTATAGGGAGTCGG
yjhG-rrnH P-F	gcgcctccaCTCATGTCTGTTCGCAATATTTTTGCTGACG
yjhG-rrnH P-R	cctgcaggcgcgccgCTTTCAGTTTTTATTCATAAAATCGCGCAAAGCC
tac-yjhG-F	aatttcacacaggaaacaGGAGCTTATCGACTGCACGGTGC	pRSFtac-yjhG-inv-yqhD
tac-yjhG-R	TGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTC
yjhG-tac-F	gataacaatttcacacaggaaacaCTCATGTCTGTTCGCAATATTTTTGCTGACGAG
yjhG-tac-R	cctgcaggcgcgccgCTTTCAGTTTTTATTCATAAAATCGCGCAAAGCC
dnaKJ-rpsT-F	aatttcacacaggaaacaGCACAAAAAATTTTTGCATCTCCCCC	pRSFdnaKJrpsT-yjhG-inv-yqhD
dnaKJ-rpsT-R	ttacgtagtgatggtATTCGGTCATCATGTGGTTGTGAG
rpsT-dnaKJ-F	ccacatgatgaccgaatACCATCACTACGTAACGAGTGCC
rpsT-dnaKJ-R	caaaaatattgcgaacagacatgagGGTCCAACTCCCAAATGTGTTCTATATGG
yjhG-KJT-F	agttggaccCTCATGTCTGTTCGCAATATTTTTGCTGACG
yjhG-KJT-R	cctgcaggcgcgccgCTTTCAGTTTTTATTCATAAAATCGCGCAAAGCC

菌株	启动子（yqhD）	OD₆₀₀	木糖转化率/%	BT/g·L^-1
KXW3009	未改造	13.9	63.3	13.6
P1	P _yqhD （野生型启动子）	15.4	58.3	9.1
P2	P _tac	13.1	64.0	10.2
P3	P _inv	10.4	73.1	14.4
P4	P _dnaKJ	12.0	66.4	14.2
P5	P _grpE	11.5	70.0	14.1